熒光定量PCR儀選擇誤區(qū)及注意要點

熒光定量PCR 因操作方便、運行速度快、實驗結(jié)果準確，受到越來越多的分子生物學研究者青睞。面對各種不同性能的產(chǎn)品，您又該如何選擇呢？

首先建議大家走出認識熒光定量PCR的兩個誤區(qū)：

誤區(qū)一：儀器通道越多越好

隨著PCR技術(shù)的成熟運用，多重擴增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。從zui初ABI公司推出的單通道熒光定量PCR儀發(fā)展到如今各個廠家都推出4通道、5通道甚至6通道熒光定量PCR儀，眼花繚亂的選擇讓人無所適從，就有人一不小心走進了“通道越多越好”的誤區(qū)。

在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時，為了確保實驗結(jié)果的性和準確性都要在實驗中使用ROX（一種熒光染料）或的Reference dye ，這些熒光染料都必須單獨使用一個檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號的有效通道只有4個，而且使用校正染料可能會增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自已廠家的的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購買前確認熒光定量PCR儀器的有效檢測通道尤為重要，不能單單只聽宣傳。

考慮多重熒光定量PCR的通道數(shù)的時候也應(yīng)該從實驗室實際情況出發(fā)，多重PCR并非人人適用、人人可用，因為它使實驗復雜化了。

誤區(qū)二：real-time PCR儀無需梯度功能

對于使用染料法的定量PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計軟件或者經(jīng)驗公式計算熔解溫度（Tm值），但運用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對于特殊片斷，經(jīng)驗公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準確的結(jié)果，退火溫度細微的差異對結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個孔的溫度控制條件可以在范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出的反應(yīng)條件。

不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對于多種聚合酶混合酶擴增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個非常重要，因為Taq和校正酶的*反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。

使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實驗才能完成的優(yōu)化過程，簡化了摸索 PCR反應(yīng)條件的繁瑣實驗，既節(jié)省實驗時間提率，又節(jié)省實驗成本。

當我們走出誤區(qū)，想要選擇一款自己需求的熒光定量PCR儀時我們又該關(guān)注些什么呢？

1、儀器的檢測通量

在購買定量PCR儀的時候要根據(jù)實驗實的需要來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR的檢測通量小到16個多到384個。如果進行一般的基因表達研究或病原體檢測，實在不必購買昂貴的儀器，96孔的通量足夠用；需要尋找要新藥靶點和疾病標記的實驗室可以考慮購買384孔板的儀器。假如經(jīng)費有限無法購買384孔板儀器的實驗室，可以考慮購買運行速度快（帶有FAST模塊）的96孔板熒光定量PCR儀。有了高通量的儀器，你會發(fā)現(xiàn)樣品的制備和小體系、多樣本的PCR體系構(gòu)建成為限制實驗速度和結(jié)果的頸瓶。Roche公司推出的MagnaPure核算純化系統(tǒng)可配合Roche的Lightcycyler熒光定量PCR儀使用。Eppendorf 的ep Motion5070、5075全自動工作站，即可解決核酸純化問題，又可進行96孔板、384孔板的PCR反應(yīng)體系構(gòu)建，不用加樣加到眼發(fā)黑、手抽筋。

2、硬件設(shè)計特點

熒光定量PCR儀主要有傳統(tǒng)的96孔板式、創(chuàng)新的離心式等，每種設(shè)計都有它的獨到之處但也都有無法避免的缺憾。

傳統(tǒng)的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無需特殊的耗材。有些傳統(tǒng)的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測，這些光學結(jié)構(gòu)在96孔板的頂部，每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同——邊緣效應(yīng)，對結(jié)果產(chǎn)生影響。為了保證、準確的實驗結(jié)果，這類儀器在實驗過程中通常會使用ROX（一種熒光染料）或的Reference dye作為參照校正實驗結(jié)果。鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經(jīng)成為很多用戶頭痛的問題。在實驗過程中鹵鎢燈作為一種熱光源，產(chǎn)生較多熱能對實驗結(jié)果有一定的影響。CCDzui大的優(yōu)點就是可以同時掃描所有樣品中的熒光信號，但是靈敏度較低，而且同時檢測樣品間的熒光信號存在干擾。像ABI、Bio-rad 公司生產(chǎn)的熒光定量PCR就屬于這一種。但Bio-rad的IQ系列熒光定量PCR帶有梯度功能。

創(chuàng)新的離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測，離心式的設(shè)計上避免了邊緣效應(yīng)。LED光源是冷光源對實驗沒有影響，因此無需采用其他熒光染料校正儀器，而且使用壽命長無需經(jīng)常更換。PMT每次只能收集單個熒光信號，但是檢測靈敏度高。但這類儀器運行速度非?？?，但也存在樣本量小、耗材昂貴、沒有梯度功能、存在時間積分等缺點。Corbett 的Rotor-gene系列和Roche 的Lightcycler系列均為這一類儀器。

隨著熒光定量PCR技術(shù)的使用，聰明的儀器生產(chǎn)商紛紛在傳統(tǒng)的96孔板儀器上大作改進。首先是Stratagene的Mx3000p在檢測上突破了使用CCD改用PMT檢測熒光信號，大大提高了實驗的靈敏度，但激發(fā)光源仍然沿用傳統(tǒng)的鹵鎢燈并且沒有梯度功能。Eppendorf 公司推出的Mastercycler ep realplex是一款帶有梯度功能的熒光定量PCR儀，使用了96個LED為激發(fā)光源，采用先進的CPM（第二代PMT）及96合一光纖為檢測系統(tǒng)，不但避免了邊緣效應(yīng)還保證所有樣品間的熒光信號沒有干擾。

3、運行速度

在熒光定量PCR儀的眾多技術(shù)參數(shù)中，升降溫速度也是廠家喜歡大力宣傳的指標。更快的升降溫，可以縮短反應(yīng)進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結(jié)合、反應(yīng)的時間，提高PCR的特異性。為了更好的完成實驗，各個廠家紛紛推出能快速運行的熒光定量PCR儀。例如ROCHE推出的Lightcycler2.0利用空氣動力學原理，可在半小時左右完成30-40個循環(huán)。ABI的7500可以選配FAST模塊擁有5°C/秒的升降溫速度，可在40分鐘左右完成30-40個循環(huán)。zui近eppendorf新推出的Mastercycler ep realplex4S 和2S的銀質(zhì)模塊熒光定量PCR儀 ，升降溫的速度可達到6℃/秒和4.5/秒，是目前同類產(chǎn)品中升降溫速度zui快的熒光定量PCR 儀。一個在其他儀器上原本需要40—60分鐘的PCR反應(yīng)，eppendorf Mastercycler ep realplex4S 和2S （銀質(zhì)模塊）只需運行28分鐘——別小看這節(jié)約下來的幾十分鐘，一天下來就可以多運行好幾輪了。

4、靈活性

大規(guī)模繁忙的實驗室設(shè)備固然讓人羨慕，但是常規(guī)實驗室同樣可以有精彩的選擇?，F(xiàn)在的儀器供應(yīng)商擁有眾多技術(shù)專家，有的還能提供整個分子生物學的基礎(chǔ)研究平臺，不但了解、滿足您現(xiàn)在的需求，而且還考慮到了你可能變化的需求——升級和更換模塊。Bio-rad的Mycycler就可以選擇模塊升級為定量PCR儀。ABI的7900可以選擇將96孔槽變?yōu)?span lang="EN-US">384孔槽。像離心式的雙通道的Rotor-gene3000A 就可以根據(jù)您研究的需要升級成四通道的熒光定量PCR儀。Eppendorf公司在這方面考慮的就更加周全，如實驗室已經(jīng)擁有Mastercycler ep可以按照您的要求升級為Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀，而且可升級的型號有4種：2通道銀質(zhì)、鋁制模塊和4通道銀質(zhì)、鋁制模塊。您可以根據(jù)自己的經(jīng)費和實驗需要購買、升級任何一款Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀。

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